近年來(lái)隨著人體組織工程學(xué)的發(fā)展，人體組織模型（細(xì)胞、組織、器官等）在藥物測(cè)試和安全性評(píng)估以及化妝品和新療法開(kāi)發(fā)領(lǐng)域有許多潛在的應(yīng)用，然而，適合于高通量篩選生物制劑的模型種類**有限。為了更等效人體組織，近日，紐卡斯?fàn)柎髮W(xué)基礎(chǔ)學(xué)院Stefan Przyborski教授帶領(lǐng)團(tuán)隊(duì)在《International Journal of Bioprinting》發(fā)表了影響因子30.20的高分文章，已被引用2953次。根據(jù)生物打印原理，該研究使用MicroFab的噴墨打印系統(tǒng)Jetlab 4對(duì)自體皮膚細(xì)胞進(jìn)行生物打印和培養(yǎng)，在停留時(shí)間為1000μs，背壓為150mmHg，每滴體積為103±1nL的條件下，能夠打印自體細(xì)胞并產(chǎn)生人體皮膚等效物（HSE），在生產(chǎn)效率和輸出一致性之間取得了良好的平衡。研究證明了成纖維細(xì)胞和角化細(xì)胞可被高精度地生物打印并保持生物活性，組織學(xué)染色顯示HSE與人類皮膚相當(dāng)，可廣泛應(yīng)用于體外鑒定單克隆抗體的免疫毒性，以建立潛在免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子譜。
隨著組織工程學(xué)的迅猛發(fā)展，使人類替換病損組織的夢(mèng)想成為現(xiàn)實(shí)，人體皮膚等效物的研究，將給燒傷、大面積潰瘍及皮膚缺損患者在臨床的檢測(cè)、診斷、治療帶來(lái)福音。然而，HSE存在體外培養(yǎng)過(guò)程周期較長(zhǎng)、難以及時(shí)滿足臨床需要等問(wèn)題。本研究使用MicroFab的噴墨打印系統(tǒng)Jetlab 4對(duì)自體皮膚細(xì)胞進(jìn)行生物精準(zhǔn)打印和培養(yǎng)，先將20μL濃度為25×106個(gè)細(xì)胞/mL的纖維細(xì)胞懸液直接打印到96孔板內(nèi)的Alvetex支架（膜厚200μm）上，如圖1，培養(yǎng)18天形成皮膚等效物，再將20μL濃度為20×106個(gè)細(xì)胞/mL的人表皮角質(zhì)細(xì)胞均勻打印在培養(yǎng)的皮膚等效物上，誘導(dǎo)培養(yǎng)表皮層分化2周，開(kāi)發(fā)出一種可擴(kuò)展、大規(guī)模制備的方法來(lái)制造HSE，能夠保持皮膚等效性和活性，可應(yīng)用于識(shí)別臨床前不良免疫反應(yīng)。
▲ 圖1 皮膚等效模型的開(kāi)發(fā)
▲ 圖2 在不同的停留時(shí)間和正氣壓下，每個(gè)液滴所分配的平均介質(zhì)體積
通過(guò)表征打印停留時(shí)間和氣壓的變化，并測(cè)量打印體積，確定**打印參數(shù)。為了測(cè)量打印體積，以200滴培養(yǎng)基D打印到1.5mL試管中的重量為基準(zhǔn)。如圖所示，在停留時(shí)間為1000μs，正壓為150mmHg，每滴體積為103±1nL的條件下打印細(xì)胞并培養(yǎng)HSE，能夠在生產(chǎn)效率和輸出一致性之間取得了良好的平衡。▲ 圖3 在靜置時(shí)間1000μs和背壓150 mmHg下，生物打印成纖維細(xì)胞和角化細(xì)胞的（A）細(xì)胞計(jì)數(shù)和（B）細(xì)胞活力
生物打印的成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力如圖3所示。打印細(xì)胞的數(shù)量和活力在兩種細(xì)胞類型中都是穩(wěn)定和一致的，這表明本研究中的生物打印設(shè)備在小體積內(nèi)分配大量細(xì)胞方面是穩(wěn)健精密和可復(fù)現(xiàn)的。
▲ 圖4 生物打印真皮和全層皮膚等效物的代表性染色
H&E染色的結(jié)果如圖4所示，圖A顯示在支架的頂表面可以看到一層分布一致的真皮成纖維細(xì)胞。H&E染色的HSE如圖B所示成纖維細(xì)胞上的表皮層清晰可見(jiàn)：基層、棘層（分化和表面遷移的角化細(xì)胞形成棘狀層）、顆粒層和**薄的角質(zhì)層。生物打印的HSE的天狼星紅染色顯示HSE真皮層中膠原蛋白含量*高(圖C)，大而厚的交聯(lián)膠原蛋白層在真皮與表皮交界處的表皮下可見(jiàn)。這層膠原蛋白橫跨真皮層，支持表皮的形成。▲ 圖5 健康人體皮膚和生物打印皮膚的代表性染色
▲ 圖6 自體共培養(yǎng)的平均促炎細(xì)胞因子濃度
促炎細(xì)胞因子的量化水平如圖6所示，在OKT3誘導(dǎo)處理的樣本中，IL-2水平顯著升高，被IL-2激活的T細(xì)胞隨后可以增加IFN-γ的表達(dá)。結(jié)果表明，生物打印人源化的HSEs，具有細(xì)胞因子的多重量化，可廣泛應(yīng)用于體外鑒定單克隆抗體的免疫毒性，以建立潛在免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子譜。本研究使用MicroFab噴墨打印系統(tǒng)Jetlab 4基于96孔板惰性支架生物打印，成功制備了人體皮膚等效物，可用于確定診斷單克隆抗體的不良免疫反應(yīng)。證實(shí)了人源皮膚細(xì)胞生物打印的可行性，并保留細(xì)胞的生物功能形成完整的HSE，與人體健康皮膚效果相當(dāng)，能夠成功地鑒定出陽(yáng)性和陰性治療抗體的不良免疫反應(yīng)。這項(xiàng)研究表明，生物打印的人體組織可以在體外識(shí)別由治療性抗體引發(fā)的不良免疫反應(yīng)，從而在臨床測(cè)試之前加強(qiáng)對(duì)新型生物制劑的臨床前評(píng)估，如疾病建模和傷口愈合建模，未來(lái)工作的一個(gè)具體方面將涉及使用神經(jīng)元和Swann細(xì)胞系對(duì)3D皮膚模型進(jìn)行神經(jīng)刺激，以進(jìn)一步驗(yàn)證模型并評(píng)估止痛藥物，對(duì)制藥工業(yè)的藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程**有益。
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