微制造方法已廣泛用于控制微米級的局部細(xì)胞環(huán)境。然而，準(zhǔn)確地模擬體內(nèi)的復(fù)雜性在同一基質(zhì)上共培養(yǎng)多種類型的細(xì)胞時，在保持形式和設(shè)計自由的同時保持組織結(jié)構(gòu)仍然是一個挑戰(zhàn)。噴墨打印是解決這個問題的**辦法之一，可以通過直接將活體細(xì)胞圖案化打印到細(xì)胞友好的液體環(huán)境中，是基礎(chǔ)生物學(xué)和應(yīng)用生物技術(shù)的強大而通用的工具。
微制造方法已廣泛用于控制微米級的局部細(xì)胞環(huán)境。然而，準(zhǔn)確地模擬體內(nèi)的復(fù)雜性在同一基質(zhì)上共培養(yǎng)多種類型的細(xì)胞時，在保持形式和設(shè)計自由的同時保持組織結(jié)構(gòu)仍然是一個挑戰(zhàn)。浦項科技大學(xué)相關(guān)課題組在“Freeform micropatterning of living cells into cell culture medium using direct inkjet printing”（發(fā)表于《Scientific Reports》）的研究中**提出了一種按需噴墨打印方法，可將活細(xì)胞直接圖案化到細(xì)胞友好的液體環(huán)境中。通過細(xì)胞噴射和撞擊行為的高速成像精確優(yōu)化打印參數(shù)，實現(xiàn)細(xì)胞位置的高分辨率控制。該課題組通過將不同的細(xì)胞共同打印成各種設(shè)計，包括復(fù)雜的梯度排列，展示了直接細(xì)胞打印方法的能力。最后，課題組通過在培養(yǎng)基填充的培養(yǎng)皿中生成以不同大小的棋盤圖案打印的A549和HeLa細(xì)胞，應(yīng)用該技術(shù)來研究細(xì)胞群的異質(zhì)性和幾何形狀對季節(jié)性H1N1流感病毒 （PR8）感染性的影響。直接噴墨細(xì)胞圖案化可以成為基礎(chǔ)生物學(xué)和應(yīng)用生物技術(shù)的強大而通用的工具。基于直接噴墨的細(xì)胞打印系統(tǒng)和工藝
研究團隊將載有細(xì)胞的墨水噴墨打印到充滿細(xì)胞培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)皿的預(yù)定位置上 （圖 1a）。使用帶有xy移動臺和z軸升降噴頭的壓電噴墨打印系統(tǒng)（Jetlab* II，MicroFab Inc.）制造復(fù)雜的細(xì)胞圖案。作為墨水，活細(xì)胞以6×106個細(xì)胞mL-1的密度懸浮在細(xì)胞培養(yǎng)基中。在打印之前評估了充滿細(xì)胞的墨水的剪切粘度。細(xì)胞通過一個直徑為80μm的噴頭 (MJ-ATP-01 80, Microfab Inc.) 從儲墨器中打印出來，并注入一池液體介質(zhì)中以進行圖案化?；罴?xì)胞通過多個步驟排列在預(yù)定的圖案上（圖 1b）。首先，使用施加的壓電信號輸入從噴墨噴頭的**噴射載有細(xì)胞的液滴。在單次閃光圖像中捕獲液滴形成的階段（圖 1c）。接下來，將排出的細(xì)胞放入培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基中（圖 1d）。當(dāng)液滴與液體介質(zhì)聚結(jié)時形成渦環(huán)。渦流在大約1毫秒內(nèi)迅速傳播到液體中，并隨著速度變慢而變得更寬。初始滲透深度為~167μm，然后細(xì)胞以~14.2μm s-1的速度緩慢分散到液體中，直到它們到達培養(yǎng)皿底部（圖 1e）。隨著時間的推移，細(xì)胞粘附在印有圖案的培養(yǎng)皿底部。▲ 圖1 直接噴墨單元打印系統(tǒng)和工藝。（a）使用3軸可控壓電噴墨打印系統(tǒng)進行直接噴墨單元圖案化的裝置示意圖。(b) 在充滿液體的板中對細(xì)胞進行圖案化的過程的示意圖。（c）使用 CCD 相機和火花閃光燈以30微秒的間隔獲得充滿細(xì)胞的液滴噴射的高速頻閃圖像。( d) 液滴撞擊充滿液體的基材后下沉細(xì)胞的高速電影圖像。( e ) 在不同的時間間隔跟蹤下沉細(xì)胞的位移。接下來，研究團隊使用3種不同的檢測方法檢查了細(xì)胞活力和增殖：在細(xì)胞打印后立即使用LIVE/DEAD檢測試劑盒進行即時測量，跟蹤細(xì)胞增殖率1周，以及長期檢查維持培養(yǎng)物中的細(xì)胞形態(tài)3周。LIVE/DEAD測定的結(jié)果顯示打印組和移液對照組之間的即時存活率差異可忽略不計（圖 2a）。打印組和對照組的存活率分別為98.6%和99.0%。一周后，打印組的細(xì)胞密切遵循移液對照組的生長曲線，F(xiàn)=0.06485。在雙向方差分析中，組間沒有觀察到顯著差異（p>0.05）（圖 2b））。此外，由于打印細(xì)胞的增殖，在第7天觀察到的打印細(xì)胞增殖高于對照組。在打印后獲得的細(xì)胞圖像中，細(xì)胞保持其形態(tài)并存活3周，代表8代（圖 2c）。沒有觀察到染色體斷裂或細(xì)胞損傷的明顯跡象。▲ 圖2 印后細(xì)胞活力測試。( a ) LIVE/DEAD測定用于測量打印后立即的細(xì)胞存活率。( b ) 每隔一天測量增殖率，持續(xù)7天。（c）監(jiān)測長期細(xì)胞形態(tài)直至第8代。比例尺：50μm。
研究團隊使用直接噴墨打印工藝對NIH3T3和HEK293A細(xì)胞的各種設(shè)計進行圖案化。首先，圖 3a顯示了印在細(xì)胞培養(yǎng)皿上的遷移測定模型，用于跟蹤和量化傷口愈合或藥物反應(yīng)測定中的細(xì)胞行為。NIH3T3細(xì)胞以受控密度進行圖案化，留下0.5和1mm的空間。每天捕獲圖像以顯示隨時間推移由細(xì)胞增殖和遷移引起的間隙閉合。接下來，NIH3T3細(xì)胞用3種不同的熒光染料，紅色、綠色和藍色（RGB）標(biāo)記，并進行圖案化以證明異型細(xì)胞圖案化的可能性（圖 3b-e）。細(xì)胞被打印成足夠精細(xì)的圖案，以顯示彎曲的設(shè)計和不同顏色組的邊緣邊界之間的區(qū)別。在驗證使用RGB標(biāo)記的細(xì)胞制造異型共培養(yǎng)模型的可能性后，使用不同的細(xì)胞系打印了真正的異型共培養(yǎng)模型（圖 3f）。NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞和HEK293A人腎細(xì)胞被共同圖案化到具有鋸齒形界面的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）中。鋸齒形圖案的邊界清晰可見，因為含有NIH3T3細(xì)胞的區(qū)域似乎比含有HEK293A細(xì)胞的區(qū)域明顯更暗。▲ 圖3 直接打印到培養(yǎng)基中的各種細(xì)胞圖案的演示。（a）具有1mm和0.5mm間隙的打印細(xì)胞遷移測定模型。比例尺：500μm。（b-e）紅色、綠色和藍色標(biāo)記的細(xì)胞圖案的熒光圖像。比例尺：1mm。（f）使用NIH3T3和HEK293A細(xì)胞的異型共培養(yǎng)模型打印的鋸齒形圖案。比例尺：1mm。除了高分辨率圖案外，直接細(xì)胞打印的另一個優(yōu)點是它能夠通過改變液滴密度來引入細(xì)胞濃度梯度。研究團隊通過簡單地打印3種RGB標(biāo)記的細(xì)胞墨水來繪制包含7種彩虹色、 青色和洋紅色的9種主要顏色的顏色圖表，以顯示在濃度梯度中對細(xì)胞進行圖案化的能力（圖 4a）。根據(jù)從所需的9種顏色獲得的預(yù)設(shè)RGB顏色比率，將細(xì)胞圖案化為9個切片方塊。例如，**行中心的橙色是通過分別以5:2:0的比例打印3個RGB標(biāo)記的單元格而著色的。這一策略舉例說明了一步控制單個培養(yǎng)皿中的細(xì)胞密度和圖案。在僅使用3個彩色單元格驗證了雜色表達之后，研究團隊嘗試模仿Georges Seura的杰作“埃菲爾鐵塔”。他們在介質(zhì)中打印了RGB標(biāo)記的細(xì)胞，通過使用并列的微小彩色點來對繪畫進行圖案化，類似于這位法國后印象派畫家使用的方法（圖 4b）。細(xì)胞密度梯度的有效控制和其噴墨打印方法的高分辨率在“埃菲爾鐵塔”打印中創(chuàng)造了一個漸進和連續(xù)的細(xì)胞分類。對細(xì)胞密度的局部控制使我們能夠在類似的印象中可視化和模仿原始特征。▲ 圖4 使用直接噴墨細(xì)胞打印的密度控制2D單元格圖案。( a ) 九色圖表打印有用紅色、綠色、藍色 (RGB) 染料標(biāo)記的單元格。比例尺：1mm。( b ) Georges Seurat 的“埃菲爾鐵塔”用標(biāo)記有3種顏色染料的細(xì)胞進行了圖案化。比例尺：1mm。這里開發(fā)的直接打印方法在液體環(huán)境中生成了多種類型細(xì)胞的自由形式圖案。活細(xì)胞的受控空間位置是通過將懸浮在小瓶中的活細(xì)胞通過按需噴墨噴頭輸送到培養(yǎng)基填充的培養(yǎng)皿中而創(chuàng)建的，而不會引起損壞。這種方法可能為更準(zhǔn)確地模擬在活生物體中觀察到的關(guān)鍵細(xì)胞 - 細(xì)胞和組織 - 組織界面提供新的機會。此外，該技術(shù)可應(yīng)用于高通量分析和藥物篩選。參考文獻：
[1] Park J A , Yoon S , Kwon J , et al. Freeform micropatterning of living cells into cell culture medium using direct inkjet printing[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1):1669.
