每秒鐘同時(shí)發(fā)生100K個(gè)1.31μm大小均一的液滴聽上去**難以實(shí)現(xiàn)，但是研究證明，電流體動(dòng)力學(xué)（EHD）打印平臺(tái)的靜電噴霧模式可以提供一個(gè)簡(jiǎn)便的平臺(tái)來有效地生產(chǎn)這種大量單分散的油包水或油包凝膠液滴，對(duì)于依賴于高度小型化和體外控制的應(yīng)用來說**強(qiáng)大。
隨著微米納米級(jí)設(shè)備的進(jìn)步，在極其微型化的水滴隔室中封裝生化反應(yīng)，重新定義了化學(xué)和生物科學(xué)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。這種基于油包水微滴隔室的封裝的關(guān)鍵作用，被稱為體外隔室化（IVC）。體外隔室化在試管環(huán)境中改變了自然選擇的使用，而無需在每個(gè)蛋白質(zhì)（表型）與其編碼基因（基因型）之間建立**聯(lián)系；這種連接一直是常規(guī)分子進(jìn)化的主要要求，但通常是一個(gè)限制步驟。IVC的這種能力突出了這樣一個(gè)事實(shí)，即它可以構(gòu)成一個(gè)系統(tǒng)，為功能性生物分子 的體外定向進(jìn)化在概念上簡(jiǎn)單且“無偏差”提供一種捷徑。IVC的****最初是基于使用渦旋和均質(zhì)化對(duì)油包水液滴進(jìn)行大量乳化而開發(fā)的。這些方法既簡(jiǎn)單又快速，但產(chǎn)量是不可預(yù)測(cè)的，并且在液滴尺寸方面表現(xiàn)出相當(dāng)大的可變性，典型的直徑范圍從1到100μm，對(duì)應(yīng)于反應(yīng)體積也有fL到nL差異。這種多分散性可能導(dǎo)致進(jìn)化中的分子潛在不均勻分布，這些分子在整個(gè)液滴群中的數(shù)量通常**大（即數(shù)百萬到千萬億），從而使精確和定量實(shí)驗(yàn)變得困難。此外，在均質(zhì)過程中發(fā)生的劇烈混合往往會(huì)導(dǎo)致IVC中使用的酶的活性損失不可接受。多分散性限制可以通過在具有精心設(shè)計(jì)的微流體幾何形狀的微通道中產(chǎn)生基本上單分散的液滴來克服。然而，基于微流體的系統(tǒng)有兩個(gè)實(shí)質(zhì)性的限制。一個(gè)限制是生產(chǎn)率低；即，一次產(chǎn)生一個(gè)液滴；該技術(shù)在產(chǎn)生**小的液滴方面也受到限制?？朔?*個(gè)限制的嘗試包括使用幾個(gè)連續(xù)的微流體模塊或先進(jìn)的微通道幾何形狀，允許以千至兆赫的頻率連續(xù)形成液滴。然而，這些方法無法納入進(jìn)化分子工程中使用的大型進(jìn)化分子庫，因?yàn)檫@些庫比微流體液滴數(shù)量的上限大幾個(gè)數(shù)量級(jí)。還有一種使用石英或聚（二甲基硅氧烷）（PDMS）微升/飛升室陣列微制造的方法，但是再次在技術(shù)上限于較低吞吐量。更為重要的是，根據(jù)現(xiàn)階段研究，體外基因表達(dá)系統(tǒng)的生產(chǎn)率與液滴的半徑成反比，并且也強(qiáng)烈地受到在散裝乳劑用于液滴產(chǎn)生的油/表面活性劑的性質(zhì)的影響。因此，一種可以整合本體形成和微流體形成等傳統(tǒng)乳化方法，以及單分散液滴的形成，是一個(gè)令人興奮的前景，它可能允許超高通量產(chǎn)生高度單分散和極小型化的液滴可以在基于IVC的定向進(jìn)化中維持相當(dāng)數(shù)量的進(jìn)化分子。電噴霧是質(zhì)譜中通常使用的一種電離技術(shù)，是一種成為產(chǎn)生散裝單分散液滴的潛在手段。電噴霧是電場(chǎng)力作用于毛細(xì)管噴嘴出口處的液體表面，形成泰勒錐；當(dāng)電場(chǎng)力超過表面張力時(shí)，射流會(huì)伸長(zhǎng)成細(xì)絲，然后自發(fā)分裂成細(xì)小且相對(duì)單分散的液滴，這些液滴遠(yuǎn)小于孔口直徑。這項(xiàng)技術(shù)已得到廣泛認(rèn)可，包括獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)；然而，它在浸沒模式下的使用仍然受到限制，主要是因?yàn)閷?duì)分散流體浸入另一種不混溶液體時(shí)的現(xiàn)象缺乏了解。油中液體的電分散可能是實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)的一項(xiàng)有趣技術(shù)。值得注意的是，有研究文獻(xiàn)說明，一種液體在另一種液體浴中的電分散比在空氣中容易得多。在這項(xiàng)研究中，使用電流體動(dòng)力學(xué)的打印平臺(tái)，將浸入式電噴霧與IVC相結(jié)合，用于超快速生成油包水液滴。與傳統(tǒng)方法（批量或微流體）相比，該平臺(tái)能夠改進(jìn)尺寸和速度控制，并且允許大規(guī)模生產(chǎn)并行IVC。靜電型噴墨噴嘴浸沒在主體油相中；當(dāng)施加電壓時(shí)，該系統(tǒng)能夠連續(xù)產(chǎn)生封裝在亞飛升液滴中的生物分子。系統(tǒng)地研究了影響液滴尺寸和單分散性的參數(shù)，包括電壓和頻率、孔口直徑尺寸和流體特性等電氣參數(shù)。該研究生產(chǎn)的電分散的油包水液滴中封裝了產(chǎn)生綠色熒光蛋白 (GFP) 和/或mCherry的無細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)。通過使用共聚焦熒光顯微鏡檢查熒光強(qiáng)度來監(jiān)測(cè)作為液滴大小函數(shù)的蛋白質(zhì)表達(dá)率。這項(xiàng)研究中，使用電流體動(dòng)力學(xué)的打印平臺(tái)，電噴霧模式來生成直徑在亞微米范圍內(nèi)的單分散液滴射流。類似于電噴霧技術(shù)，導(dǎo)電液體通過帶電的毛細(xì)管噴嘴緩慢注入。由于其表面張力，毛細(xì)管噴嘴內(nèi)的液體達(dá)到半球形彎液面。在施加脈沖直流電壓的情況下，由于彎月面區(qū)域附近的離子積累，會(huì)出現(xiàn)切向電應(yīng)力。在特定的閾值電壓下，會(huì)出現(xiàn)瑞利不穩(wěn)定性現(xiàn)象，導(dǎo)致靜電力與作用于水面的表面張力不平衡。這導(dǎo)致圓錐形狀的形成，通常稱為泰勒錐，從泰勒錐的**噴出細(xì)細(xì)的液體微絲，最終碎裂形成單分散液滴的噴霧。產(chǎn)生的液滴的大小與毛細(xì)管的直徑無關(guān)，可以獲得小于微米的液滴。該技術(shù)的基本實(shí)驗(yàn)裝置描述如圖1。通過細(xì)電極線連接到高壓電源控制器單元的毛細(xì)管噴嘴浸入充滿油/表面活性劑混合物的透明底部?jī)?chǔ)液器（用于可視化）中。電場(chǎng)是通過從毛細(xì)管噴嘴施加高壓產(chǎn)生的，由生物分子組成的液體通過噴嘴被擠出和噴射。如圖1所示，油包水毫微微級(jí)隔室由單分散水性液滴，隨后可以通過相互擴(kuò)散的產(chǎn)生形成/表面活性劑的油滴混合物。實(shí)時(shí)和高速成像用于捕捉噴射破碎成離散液滴的釋放。激光掃描共聚焦顯微鏡用于對(duì)油包水液滴隔室進(jìn)行成像。如圖2a所示，液滴的平均尺寸是通過動(dòng)態(tài)光散射計(jì)算的，當(dāng)使用具有4μm孔口直徑的噴嘴時(shí)，發(fā)現(xiàn)其尺寸為1.31μm。根據(jù)計(jì)算，使用該實(shí)驗(yàn)裝置在單個(gè)脈沖中產(chǎn)生了55到108個(gè)液滴（圖 1）。在1kHz的**頻率下，即每秒1000個(gè)脈沖，當(dāng)前設(shè)置導(dǎo)致以接近每秒100000個(gè)的速率產(chǎn)生單分散水滴每秒液滴。通過使用更高頻率生產(chǎn)率可以進(jìn)一步提高大約2個(gè)數(shù)量級(jí)。 ▼ 圖2 毫微微級(jí)體外劃分的尺寸測(cè)量
為了在這些微小的飛升液滴內(nèi)進(jìn)行定向分子進(jìn)化，需要更換溶液或添加多個(gè)洗滌步驟以去除不需要的分子。然而，當(dāng)使用帶有油包水液滴的獨(dú)立油層時(shí)，這些步驟可能會(huì)出現(xiàn)問題。最近，水凝膠基質(zhì)（如瓊脂糖）在液滴內(nèi)的應(yīng)用被廣泛期待作為多步驟過程的基質(zhì)支持，因?yàn)榭梢越粨Q小分子，而凝膠基質(zhì)保留更大和更理想的分子，如蛋白質(zhì)。此外，與水中的無限制酶相比，載體（水凝膠）基質(zhì)對(duì)酶活性的影響可能更明顯。當(dāng)采用這種方法時(shí)，低熔點(diǎn)瓊脂糖的使用賦予了靈活的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)換特性。因此，接下來研究團(tuán)隊(duì)評(píng)估了他們的系統(tǒng)生產(chǎn)單分散飛升油包水凝膠珠的能力，這是傳統(tǒng)微流體工藝難以獲得的。他們封裝了超低膠凝瓊脂糖，其熔點(diǎn)約為55°C，膠凝點(diǎn)低于15°C，在油包水滴內(nèi)包裹熒光染料。如圖2b所示，油包瓊脂糖凝膠珠的平均尺寸是通過動(dòng)態(tài)光散射計(jì)算的，當(dāng)使用具有15μm孔口直徑的噴嘴時(shí)，發(fā)現(xiàn)其尺寸為1.55μm。電噴霧后，生成的油包瓊脂糖液滴在冷卻（從37°C 到4°C）后轉(zhuǎn)化為油包瓊脂糖凝膠珠。在典型的噴墨中，粘度和表面張力等參數(shù)是影響液滴尺寸的關(guān)鍵因素。因?yàn)樗麄兪褂脦Ыn噴嘴的靜電噴墨作為電噴霧方法，射流分解成不同大小的液滴主要受噴嘴大小、水相的表面張力、油相的粘度和各種儀器參數(shù)，包括電壓供應(yīng)、偏置和頻率。首先，噴嘴的尺寸決定了泰勒錐的幾何形狀，根據(jù)噴嘴的孔口直徑，可以在噴射噴霧中產(chǎn)生不同的模式（例如，錐形射流或振蕩射流）。所以，圖3a顯示了2種不同噴嘴尺寸（4μm和65μm）的液滴尺寸分布，同時(shí)保持其他參數(shù)不變。大噴嘴提供大接口面積；因此，在外部電場(chǎng)的影響下，每個(gè)液滴在界面處受到不平衡應(yīng)力，導(dǎo)致振蕩噴射模式，導(dǎo)致更寬的液滴尺寸分布。相比之下，小噴嘴提供的界面面積較小，導(dǎo)致錐形噴射模式。因此，與較小的噴嘴相比，在較大噴嘴的情況下觀察到多分散性。其次，射流的面積由發(fā)生噴霧的介質(zhì)決定。因?yàn)榭諝馓峁┑哪Σ亮梢院雎圆挥?jì)，噴墨打印在空氣中產(chǎn)生液滴比在油的情況下更方便，其中粘性力（或摩擦力）在界面處施加剪切應(yīng)力。然而，與空氣相比，油介質(zhì)增加了水滴的穩(wěn)定性，產(chǎn)生衛(wèi)星水滴的可能性較小。研究觀察到平均液滴尺寸隨著粘度的增加而增加，如圖3b。此外，針對(duì)高溫（90°C 5分鐘）和儲(chǔ)存時(shí)間（25°C 24小時(shí)）評(píng)估了生成的液滴的穩(wěn)定性。沒有觀察到對(duì)液滴平均尺寸的顯著影響。第三，*容易推測(cè)電壓和頻率對(duì)液滴尺寸分布的依賴性，因?yàn)楫?dāng)向液體施加電壓時(shí)會(huì)發(fā)生電噴霧，并且施加電壓的頻率會(huì)影響作用在界面上的力。施加的偏置電壓的增加會(huì)增加界面處的液體量，從而產(chǎn)生更大的液滴尺寸。與這種關(guān)系一致，當(dāng)在100Hz的恒定頻率下將偏置電壓從100V增加到1000V時(shí)，研究團(tuán)隊(duì)觀察到向更大液滴尺寸的轉(zhuǎn)變。然而，在更高的頻率下由于水相和油相界面處的干擾增加，電壓會(huì)促使更小的液滴尺寸，這導(dǎo)致產(chǎn)生與較低頻率相比更小的液滴。▼ 圖3 電噴霧參數(shù)對(duì)油包水液滴尺寸分布的影響
作為超細(xì)電噴霧用于IVC用途的證明，其中基因被分隔和表達(dá)，通過用PURE系統(tǒng)封裝GFP編碼基因作為無細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)，在飛升液滴內(nèi)進(jìn)行GFP合成在飛升液滴中。將帶有PURE表達(dá)系統(tǒng)的GFP編碼cDNA (35 nM) 置于4μm玻璃噴嘴中，使用電噴霧產(chǎn)生油包水液滴，然后在37°C下孵育2小時(shí)。如圖4a所示，使用共聚焦顯微鏡成功監(jiān)測(cè)了GFP熒光。因?yàn)樵跊]有GFP-cDNA的情況下產(chǎn)生的液滴中檢測(cè)到的熒光量可以忽略不計(jì)，所以*明顯熒光是由于液滴內(nèi)新合成的GFP的積累所致。圖4a 中的熒光強(qiáng)度圖清楚地描繪了對(duì)照（無模板）和樣品（有模板）之間的差異。研究團(tuán)隊(duì)觀察到GFP熒光的**液滴直徑為0.81μm，對(duì)應(yīng)于0.3fL的體積。▼ 圖4 電噴霧產(chǎn)生的亞飛升油包水液滴中的體外蛋白質(zhì)表達(dá)
研究結(jié)果表明，靜電噴墨系統(tǒng)可以提供一個(gè)簡(jiǎn)便的平臺(tái)來有效地生產(chǎn)大量單分散的油包水或油包凝膠液滴，對(duì)于依賴于高度小型化和體外控制的應(yīng)用來說**強(qiáng)大。
參考文獻(xiàn)：
[1] Sharma, B. et al. A bulk sub-femtoliter in vitro compartmentalization system using super-fine electrosprays. Sci. Rep. 6, 26257; doi: 10.1038/srep26257 (2016).
