Hwa-Rim Lee所在課題組通過(guò)將藻酸鹽-孢子懸浮液打印到氯化鈣溶液中來(lái)產(chǎn)生帶有固定孢子的微粒，證明了噴墨打印具有固定藻類(lèi)的巨大潛力，并且控制包囊孢子數(shù)量及其微環(huán)境的能力可以促進(jìn)對(duì)包囊孢子微觀相互作用的研究。
藻類(lèi)細(xì)胞固定化是廢水處理、有用代謝物生產(chǎn)和養(yǎng)殖管理的常用技術(shù)。然而，目前技術(shù)中對(duì)固定液滴的大小、微生物種群和生產(chǎn)率的控制需要改進(jìn)。在這里，Hwa-Rim Lee所在課題組**使用按需噴墨打印將海藻的孢子固定在海藻酸鹽微粒中。通過(guò)將藻酸鹽-孢子懸浮液打印到氯化鈣溶液中來(lái)產(chǎn)生帶有固定孢子的微粒。他們證明噴墨技術(shù)可以通過(guò)改變墨水中的孢子密度將噴射液滴中的孢子數(shù)量控制在0.23到1.87的范圍內(nèi)。在基于打印的孢子封裝后，他們觀察到菌體的初始發(fā)芽和持續(xù)生長(zhǎng)，直到培養(yǎng)45天。該研究表明，噴墨打印具有固定藻類(lèi)的巨大潛力，并且控制封裝孢子數(shù)量及其微環(huán)境的能力可以促進(jìn)對(duì)封裝孢子微觀相互作用的研究。將藻類(lèi)細(xì)胞固定在聚合物水凝膠中具有廣泛的應(yīng)用。固定化藻細(xì)胞可用于污水處理，以去除養(yǎng)分、金屬和工業(yè)污染物。捕獲的藻類(lèi)細(xì)胞還可用于產(chǎn)生代謝物、測(cè)量毒性、通過(guò)冷凍保存細(xì)胞以及管理原種培養(yǎng)物。該技術(shù)還能夠改善固定化藻細(xì)胞的代謝、功能和生長(zhǎng)。在水凝膠顆粒中捕獲微生物的方法包括將細(xì)胞懸浮液常規(guī)滴入裝有硬化溶液的容器中；擠壓滴水；重力驅(qū)動(dòng)滴水；懸浮噴涂。所有這些方法要么速度慢，要么無(wú)法充分控制液滴的大小、微生物含量或生產(chǎn)率。一種實(shí)用的方法將克服這些缺點(diǎn)。按需噴墨（DOD）噴墨打印廣泛用于各種領(lǐng)域，如生物打印、印刷電子和3D制造。DOD壓電噴墨打印在壓電噴墨打印機(jī)的噴嘴通道中使用了一個(gè)壓電致動(dòng)器。電壓脈沖會(huì)減少裝有墨水的腔室的體積，因此有些會(huì)以液滴的形式噴出。壓電噴墨打印可以在>10kHz下產(chǎn)生大小為1–100pL的液滴。噴射液滴的大小可以通過(guò)調(diào)整輸入電壓脈沖或選擇合適的噴嘴來(lái)控制，并且小于水凝膠中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝物的擴(kuò)散極限（100-200μm）。小尺寸的微?？梢允共东@的藻類(lèi)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的抑制作用**化。由于能夠噴射少量墨水，噴墨打印已被用于封裝大分子、藥物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。▲ 圖1 鈣離子與藻酸鹽水凝膠交聯(lián)的“雞蛋盒”結(jié)構(gòu)示意圖海藻酸鹽是海藻和細(xì)菌生物膜中的主要多糖之一，是β-D-甘露糖醛酸（M嵌段）和α-L-古洛糖醛酸（G嵌段）的共聚物。藻酸鹽可以在鈣(Ca2+)或鎂(Mg2+)離子存在下形成水凝膠。特別是藻酸鹽中的G嵌段有助于形成強(qiáng)且可逆的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，即所謂的“蛋盒結(jié)構(gòu)”（圖1）。由于獨(dú)特的蛋盒結(jié)構(gòu)，海藻酸鹽已被用于化妝品、食品、生物醫(yī)學(xué)/制藥目的和鋰離子電池中的各種涂層應(yīng)用。由于海藻酸鹽主要是從包括E.cava在內(nèi)的微藻中分離出來(lái)的，因此選擇海藻酸鹽作為聚合物用噴墨打印技術(shù)固定E.cava孢子。本研究的目的是證明海藻酸鹽噴墨印打印技術(shù)在固定腔孢藻孢子方面的能力。課題組測(cè)量了藻酸鹽-孢子懸浮液的粘度并評(píng)估了液滴噴射和噴射特性的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，以評(píng)估懸浮液的噴墨打印性。然后，他們監(jiān)測(cè)液滴中的孢子數(shù)量以量化遞送的可控性。最后對(duì)固定化孢子在PESI/GeO2培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)進(jìn)行量化，以揭示藻類(lèi)孢子固定化技術(shù)的兼容性。海藻酸鈉-孢子懸浮液制劑。海藻酸鈉購(gòu)自美國(guó)MP Biomedical LLC。從韓國(guó)濟(jì)州島海岸收集E.cava的生殖菌體，然后用冰盒運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室。用自來(lái)水清洗泰菌體以去除鹽、沙子和微生物。收集包括孢子囊在內(nèi)的菌體中間部分，并將碎片置于無(wú)菌海水中以釋放孢子。使用脫脂棉過(guò)濾孢子懸浮液。來(lái)自褐藻（SigmaAldrich，美國(guó)）的2%(w/v)海藻酸鈉溶液在120°C下高壓滅菌20分鐘，在室溫下冷卻并使用0.45μm注射器過(guò)濾器過(guò)濾。將溶液與孢子懸浮液混合以制備最終的0.5%(w/v)海藻酸鈉溶液，濃度為0.125×106、0.500×106或2.00×106個(gè)細(xì)胞ml-1。粘度測(cè)量。在室溫下使用錐板旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)（DV2T，Brookfeld AMETEK，US）測(cè)量懸浮液的剪切粘度。粘度計(jì)有一個(gè)半徑為2.4cm的旋轉(zhuǎn)錐和一個(gè)固定板。將海藻酸鈉-孢子懸浮液（0.5ml）置于板和錐體之間。剪切速率介于50s?1和1,500s?1之間，持續(xù)60s；粘度是通過(guò)最后10秒（n=3）的平均老化數(shù)據(jù)得出的。海藻酸鈉-孢子懸浮液的噴墨打印。使用DOD噴墨打印系統(tǒng)（Jetlab II，MicroFab Technologies，Inc.，USA）打印海藻酸鈉-孢子懸浮液。使用直徑為80μm的壓電噴墨噴嘴，并在雙極模式下以±80V施加電壓脈沖。波脈沖的上升時(shí)間為6.0μs，停留時(shí)間為13μs，下降時(shí)間為9.0μs，回波時(shí)間為22μs。打印系統(tǒng)中配備的頻閃CCD相機(jī)和短時(shí)LED燈每30微秒獲取一次噴射形成的圖像。在載玻片上生成打印的海藻酸鈉孢子懸浮液陣列。陣列的液滴間距為400μm，載物臺(tái)速度為50mms?1。在光學(xué)顯微鏡下觀察打印的陣列并計(jì)算每滴孢子的平均數(shù)（n=30）。孢子固定化藻酸鹽微粒的制備和培養(yǎng)。使用噴墨打印系統(tǒng)打印海藻酸鈉-孢子懸浮液，將打印的液滴收集在35毫米培養(yǎng)皿中，該培養(yǎng)皿中含有1%（w/v）溶解在海水中的CaCl2。海水已在120°C下高壓滅菌20分鐘，在室溫下冷卻并通過(guò)0.45μm過(guò)濾器。打印以1,000Hz的噴射頻率進(jìn)行30分鐘。使用1厘米長(zhǎng)的磁力攪拌棒攪拌溶液以防止水凝膠顆粒聚集。打印后，將70μl產(chǎn)生的微粒懸浮液與200μl補(bǔ)充有GeO2的PESI培養(yǎng)基混合，并輸送到96孔板的每個(gè)孔中。樣品在15°C、30μmolm-2s-1的光強(qiáng)度和10小時(shí)光照：14小時(shí)黑暗的日光周期下孵育。在培養(yǎng)的第3、8、14和21天，在顯微鏡下測(cè)量E.cava配子體的總長(zhǎng)。根據(jù)所使用的海藻酸鈉溶液濃度為0.125×106、0.500×106或2.00×106個(gè)細(xì)胞ml-1不同，E.cava的配子植體的測(cè)量數(shù)量不同。(n0.125=7,n0.500=15,n2.00=20)
▲ 圖2 基于壓電噴墨打印技術(shù)生成孢子固定微粒的系統(tǒng)示意圖
所有定量數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用Origin 2016（美國(guó)馬薩諸塞州Origin實(shí)驗(yàn)室）進(jìn)行單向方差分析（ANOVA）和Bonferroni后分析。p值<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。孢子固定化藻酸鹽微粒的制備策略。圖2說(shuō)明了用于生成含有孢子的海藻酸鹽微粒的餅狀壓電按需噴墨打印系統(tǒng)。當(dāng)向噴墨噴嘴的壓電致動(dòng)器施加電壓脈沖時(shí)，噴嘴會(huì)噴射出一系列海藻酸鈉-孢子懸浮液的皮升液滴，這些液滴沉入容器中的CaCl2溶液中。一旦液滴撞擊溶液表面，Ca2+就會(huì)進(jìn)入海藻酸鹽分子的古洛糖酸鹽塊，從而與相鄰的古洛糖酸鹽塊形成連接。結(jié)果，基于藻酸鹽的液滴被交聯(lián)并轉(zhuǎn)化為包裹孢子的水凝膠微粒。將容器中的溶液磁力攪拌以防止水凝膠顆粒聚集（補(bǔ)充圖1）。海藻酸鈉-孢子懸浮液的粘度和射流形成。在5×101和103s-1之間的剪切速率范圍內(nèi)測(cè)量海藻酸鈉-孢子懸浮液的粘度，以檢查其可打印性。所有懸浮液的粘度都<20mPa?s，這對(duì)于穩(wěn)定打印來(lái)說(shuō)是適當(dāng)?shù)牡停▓D3a）。由于孢子**小（幾微米）和低范圍的孢子密度（0.125×106ml-1到2.00×106ml-1），孢子密度對(duì)粘度沒(méi)有顯著影響。然后，課題組觀察了它們的噴射行為2小時(shí)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有觀察到噴嘴堵塞。他們的射流形成的代表性高速圖像如圖3b所示。在相同的驅(qū)動(dòng)波形和可忽略不計(jì)的剪切粘度差異下，觀察到液滴速度隨著孢子密度的增加而降低。他們推測(cè)懸浮液內(nèi)的E.cava孢子自然分泌的成分可能會(huì)略微增加墨水的彈性。▲ 圖3 (a)不同E.cava孢子密度的海藻酸鈉-孢子懸浮液的粘度(b)由相同輸入電壓驅(qū)動(dòng)的射流形成圖像（插圖）
每滴平均孢子數(shù)。為了量化孢子傳遞的可控性，課題組通過(guò)將海藻酸鈉-孢子懸浮液的點(diǎn)陣打印到玻璃基板上而不交聯(lián)來(lái)研究液滴中的孢子數(shù)量。然后，使用顯微鏡計(jì)算液滴中的孢子數(shù)（圖4a，b）。點(diǎn)陣檢查顯示，隨著孢子密度的增加，每滴孢子的平均數(shù)量增加：0.125×106ml-1時(shí)為0.23，0.500×106ml-1時(shí)為0.67，2.00×106ml-1時(shí)為1.87（圖3）。4f），隨著孢子密度的增加，點(diǎn)的大小減?。▓D4c-e）。然而，每滴的平均孢子數(shù)沒(méi)有像懸浮液的孢子密度那樣增加。孢子種群可能增加了懸浮液的粘度和彈性，并減少了噴嘴的墨水噴射量，這在之前的研究中也觀察到?？刂品庋b孢子數(shù)量及其微環(huán)境的能力表明，壓電噴墨打印技術(shù)可能用作研究封裝孢子微觀相互作用的方法。
▲ 圖4 打印點(diǎn)陣圖案以計(jì)算每個(gè)液滴的平均孢子數(shù)。點(diǎn)陣的顯微鏡圖像，放大倍數(shù)為20x(a)和40x(b)。具有0.125×106個(gè)細(xì)胞ml-1(c)、0.500×106個(gè)細(xì)胞ml-1(d)和2.00×106個(gè)細(xì)胞ml-1(e)的海藻酸鈉-孢子懸浮液點(diǎn)的代表性圖像。玻璃基板上噴射液滴的尺寸約為200μm(c)、150μm(d)和130μm(e)。白色箭頭表示孢子。(f)與孢子密度相關(guān)的每個(gè)液滴的實(shí)驗(yàn)和計(jì)算平均孢子數(shù)（*p<10-4，**p<10-5與在2.00×106個(gè)細(xì)胞ml-1處獲得的值相比）。固定在藻酸鹽微粒中的E.cava孢子的產(chǎn)生和培養(yǎng)。微粒是使用噴墨打印系統(tǒng)產(chǎn)生的，容器中裝有CaCl2交聯(lián)溶液，如圖2所示。為了監(jiān)測(cè)載有孢子的微粒的形態(tài)，使用顯微鏡觀察它們。E.cava的孢子固定在藻酸鹽微粒內(nèi)（圖5，白色箭頭）。藻酸鹽與鈣離子的交聯(lián)從打印液滴的邊界快速進(jìn)行，在此過(guò)程中不考慮孢子的損失，并且預(yù)期的包囊孢子數(shù)量與圖4中的相同。固定在內(nèi)部的孢子數(shù)量微粒隨著懸浮液的孢子密度增加而增加。由于磁力攪拌器的劇烈攪拌，形成的微粒形狀為橢圓形。 
▲ 圖6 (a)固定在具有不同孢子密度的藻酸鹽微粒中的E.cava配子體的代表性圖像(b)固定在藻酸鹽微粒中的E.cava配子體的距骨長(zhǎng)度
對(duì)捕獲的孢子的突出和生長(zhǎng)進(jìn)行了45天的監(jiān)測(cè)，以證明藻類(lèi)孢子固定技術(shù)的兼容性。固定在微粒中的孢子保持休眠狀態(tài)直到第8天（圖6），然后葉狀體開(kāi)始生長(zhǎng)。第14天的平均菌體長(zhǎng)度達(dá)到~10μm，第21天達(dá)到~30μm。培養(yǎng)45天后，E.cava顯示出灌木狀形態(tài)。由于孢子是從孢子體中收集的，因此生長(zhǎng)中的E.cava顯示出配子體表型。結(jié)果表明，噴墨打印可用于固定藻類(lèi)細(xì)胞。此外，生長(zhǎng)趨勢(shì)不受孢子密度的顯著影響。結(jié)果表明，水凝膠微粒內(nèi)低至中等密度的E.cava孢子不會(huì)顯著影響彼此的葉綠體形態(tài)。發(fā)生這種影響的孢子密度范圍應(yīng)在未來(lái)的研究中確定。在這項(xiàng)研究中，壓電噴墨打印技術(shù)用于將E.cava孢子固定在海藻酸鈉懸浮液中。粘度和液滴形成行為表明它們是適合噴墨打印的材料。孢子的空間密度可能會(huì)影響海藻酸鈉-孢子懸浮液的粘度和彈性，從而影響噴射形成和低于預(yù)期的平均每液滴孢子數(shù)。打印技術(shù)允許制造孢子固定的藻酸鹽微粒。微粒的培養(yǎng)產(chǎn)生了健康的E.cava配子體，而對(duì)孢子密度沒(méi)有顯著依賴性。這些結(jié)果表明，噴墨打印可用于固定藻類(lèi)細(xì)胞和單細(xì)胞封裝。參考文獻(xiàn)：
[1] Lee H R , Sang M J , Yoon S , et al. Immobilization of planktonic algal spores by inkjet printing[J]. Scientific Reports, 2019, 9(1):1-7.
