3D打印高分辨率圖案化細胞結(jié)構(gòu)

2021-09-15 09:45
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生物打印是一種用于制造活組織的新興技術(shù)，它允許將細胞排列在預(yù)定的3D結(jié)構(gòu)中。然而，包含多種細胞類型的高分辨率生物打印結(jié)構(gòu)的例子有限。一種低成本工藝被提出，該工藝采用含有哺乳動物細胞的液滴的3D打印，以在油中產(chǎn)生堅固的、有圖案的構(gòu)造，并將其可重復(fù)地轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中。以組織相關(guān)密度（107個細胞/mL) 和1nL的高液滴分辨率。打印出具有≤200μm特征的高分辨率3D幾何圖形；這些包括一個樹枝狀細胞連接、一個對角平面連接和一個骨軟骨界面。打印的細胞顯示出高活力（平均90%），打印結(jié)構(gòu)內(nèi)的HEK細胞在培養(yǎng)條件下增殖。值得注意的是，一項組織工程研究表明，打印的oMSCs可以沿軟骨細胞譜系分化，以產(chǎn)生含有II型膠原蛋白的軟骨樣結(jié)構(gòu)。




大多數(shù)組織由多種細胞類型組成，這些細胞類型以細胞間通訊和功能所需的3D排列方式組織。體外活組織的制造涉及重現(xiàn)這種復(fù)雜的細胞結(jié)構(gòu)，這*難以受控方式進行。然而，現(xiàn)在的細胞打印技術(shù)和3D細胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展使得簡單組織能夠從打印的細胞構(gòu)建體成熟，這些細胞構(gòu)建體是一種或多種細胞的3D組織。具有生理形態(tài)和復(fù)雜性的人造組織已用于外科植入、毒理學(xué)和腫瘤模型。在“High-Resolution Patterned Cellular Constructs by Droplet-Based 3D Printing”的研究中，研究團隊將以前用于3D打印具有組織樣功能的水滴網(wǎng)絡(luò)的方法擴展到活細胞的高分辨率圖案。此外，這種低成本方法能夠在組織相關(guān)細胞密度下重復(fù)打印具有高細胞活力的3D構(gòu)建體，液滴分配體積低至1nL，即液滴分辨率介于傳統(tǒng)噴墨打印機和基于閥門的生物打印機之間。

研究團隊使用了一種單液滴具有1nL液滴分辨率的高精度細胞打印方法（這種生物打印方法，通?？梢岳肐nkjet技術(shù)或者EHD噴墨打印技術(shù)來實現(xiàn)，這兩種打印方法，RUIDU都可提供高精度的打印系統(tǒng)，以及成熟的技術(shù)支持）。浸入油中的打印細胞結(jié)構(gòu)隨后被封裝在凝膠薄層中，以轉(zhuǎn)移到水性介質(zhì)中。通過這種方式，研究團隊從兩組細胞中生成了圖案結(jié)構(gòu)，具有高分辨率3D特征，包括寬度低于200μm的層和通道，在堅固的立方毫米尺度結(jié)構(gòu)內(nèi)。摻入的細胞最初顯示出高活力（平均90%）并且以107個細胞/mL的組織樣密度存在，即與基于液滴的生物打印過程的**報告密度相同。細胞增殖發(fā)生在幾天內(nèi)，同時細胞活力總體增加（平均>95%）。值得注意的是，打印結(jié)構(gòu)中的綿羊間充質(zhì)干細胞（oMSCs）對轉(zhuǎn)化生長因子-β3（TGF-β3）有反應(yīng)并經(jīng)歷分化以形成軟骨樣結(jié)構(gòu)。這些數(shù)據(jù)表明，基本的生物過程在打印后可以保持完整，表明這里介紹的方法將適用于復(fù)雜的組織制造。

細胞結(jié)構(gòu)的3D打印


細胞結(jié)構(gòu)的高分辨率制造是通過使用3D打印機實現(xiàn)的，該打印機以前用于打印被油中脂質(zhì)單層包圍的水滴。打印機修改允許加載在液滴內(nèi)的哺乳動物細胞在基于水凝膠的生物墨水中進行圖案化（圖1和2，方法）。然后將打印的細胞構(gòu)建體封裝在凝膠薄層中以允許轉(zhuǎn)移到水性介質(zhì)中（圖3）。選擇人胚腎（HEK-293T）細胞衍生物（補充方法）來評估打印方法，而oMSCs用于研究打印構(gòu)建體中細胞的分化能力。

▲ 圖1 細胞結(jié)構(gòu)的3D打印。（a）細胞打印示意圖。分配噴嘴將含有細胞的生物墨水液滴噴射到含有脂質(zhì)的油中。油滴通過油容器的程序運動定位。液滴通過形成液滴界面脂質(zhì)雙層而凝聚。（b）共聚焦熒光顯微照片顯示無細胞打印結(jié)構(gòu)內(nèi)的液滴界面雙層（染成黃色）（11×14×7個液滴）。通過向打印溶液中添加sulforhodamine-101（~10μM）來觀察雙層。（比例尺=100μm）。（c）直方圖顯示油下打印液滴中的平均HEK-293T細胞密度作為生物墨水中細胞密度的函數(shù)。細胞密度計算為每個液滴的平均細胞數(shù)（n=25）除以平均液滴體積。誤差棒代表液滴尺寸方差和每個液滴方差的單元格的復(fù)合誤差。（d）包含兩種細胞類型的圖案化細胞結(jié)的明場顯微照片，打印為從兩個玻璃噴嘴（d=~150μm）噴出的1nL 液滴（d=130μm）的連續(xù)層。（e）油下打印的HEK-293T細胞構(gòu)建體（11×14×2液滴）的共聚焦熒光顯微照片。分別用鈣黃綠素-AM（CAM，綠色）和碘化丙啶（PI，紅色）進行活/死細胞染色?？梢姶蠹s700個細胞，4×107個細胞/mL，存活率為85%（通過手動細胞計數(shù)確定）。（比例尺=150μm）。（f）在HEK-293T細胞構(gòu)建體（7×8×4液滴）上進行的活/死測定的高倍放大共聚焦熒光顯微照片，打印起始濃度為1.5×107個細胞/mL，平均占用率每滴38個細胞相當(dāng)于3×107個細胞/mL?？梢钥吹揭恍┮旱芜吔纭＃ū壤?75μm）。

▲ 圖2 兩種細胞類型的高分辨率圖案。（a-c, e,f）打印后立即在油中打印細胞結(jié)構(gòu)的共聚焦熒光顯微照片。用深紅色（DR）或紅色 CMPTX（RC）CellTracker?染料染色的HEK-293細胞分別呈藍色和黃色假色。（a）方形結(jié)構(gòu)內(nèi)的Y形結(jié)構(gòu)（8×9×4個液滴），平均特征寬度為180μm。（比例尺=200μm）。（b）方形結(jié)構(gòu)內(nèi)的HEK-293細胞的十字形圖案（10×12×5個液滴）。（比例尺=250μm）。（c）（b）中圖案化HEK-293細胞的高倍放大圖像。（比例尺=100μm）。（d）立方體細胞結(jié)構(gòu)的3D模型，在x-z平面的對角線上具有兩個HEK群體（HEK 1，黃色；和 HEK 2，青色）之間的界面。（e，f）根據(jù)（d）中的模型打印的細胞構(gòu)建體（21×24×7個液滴）在固定垂直位置（分別為45和192μm）的部分橫截面，顯示了兩個HEK群體。（比例尺=250μm）。（g-j）層狀結(jié)構(gòu)的側(cè)面圖像，包括相轉(zhuǎn)移前后的CellTracker?染色的HEK-293細胞。下部DR染色的HEK-293細胞層（黃色）為3滴厚，而上部RC染色的HEK-293細胞層（藍色）為4滴厚（g,h）或3滴厚（i ,j）。記錄圖像：（g）在第0天，在油中，打印后立即；（h）轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基后立即；（i）在培養(yǎng)基培養(yǎng)的第3天；（j）在培養(yǎng)的第5天，在培養(yǎng)基中。（比例尺=250μm）。

▲ 圖3 含有HEK-293T細胞的打印結(jié)構(gòu)的相轉(zhuǎn)移和培養(yǎng)。（a）打印結(jié)構(gòu)的凝膠封裝和相轉(zhuǎn)移。通過在4°C下靜置20到25分鐘使打印的細胞構(gòu)建體凝膠化，并通過在室溫下用硅油AR20洗滌去除油中的脂質(zhì)。然后將構(gòu)建體涂上一層薄薄的無細胞生物墨水，通過在4°C下靜置20到25分鐘使其凝膠化。然后將凝膠化的構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到油培養(yǎng)基兩相系統(tǒng)的上相中。構(gòu)建體通過油落入培養(yǎng)基中。（b）在油下打印后立即打印為長方體結(jié)構(gòu)（7×8×4液滴）的活/死染色HEK-293T細胞的z-stack 3D重建圖像。打印液滴的平均密度為2.9×107個細胞/mL，存活率為96%。（比例尺=200μm）。（c）凝膠封裝并轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基后活/死染色打印HEK-293T細胞的z-stack 3D重建圖像。（比例尺=200μm）。（d）圖表顯示了在轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基后第0天五個打印構(gòu)建體的HEK-293T細胞活力（包括平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差）。通過使用自動對象計數(shù)來確定生存力，其值使用未經(jīng)修改或相對于平均細胞大小解析。（e）第7天在培養(yǎng)基中的構(gòu)建體上進行的免疫細胞化學(xué)z-stack 3D重建圖像：細胞核（DAPI，藍色）；活細胞的細胞質(zhì)（CAM，綠色）和；有絲分裂標(biāo)記（磷酸組蛋白H3 ICC、PH3、白色）。（比例尺=200μm）。

由于構(gòu)建體是在油中組裝的，因此液滴以六邊形陣列堆積。相比之下，當(dāng)在空氣中打印液滴時，它們會變平，并且在水平面上的打印分辨率會降低。構(gòu)建體可以用高濃度的細胞打印，而不會出現(xiàn)明顯的聚結(jié)或結(jié)構(gòu)保真度的損失，這歸因于Fmoc-二肽的摻入和生物墨水中胎牛血清（FBS）的省略。為了在凝膠封裝和相轉(zhuǎn)移過程中穩(wěn)定構(gòu)建體，生物墨水補充有瓊脂糖（1.0至1.2w/v%），使打印的圖案保留在固化的水凝膠中。Fmoc-二肽的存在還通過增加打印液滴之間的界面粘附力來幫助圖案保留，從而產(chǎn)生更具凝聚力的結(jié)構(gòu)。

參考文獻：

[1] Graham A   ,   Olof S N ,   Burke M J , et al. High-Resolution Patterned Cellular Constructs by Droplet-Based 3D Printing[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1).


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